En biologia molecular, una bona elecció i preparació de memòria intermèdia per a diferents passos d'aïllament d'ADN pot ser la diferència entre passar a l'expressió de proteïnes o obrir un altre kit de maxi-prep per començar de nou. Malgrat la seva importància crucial, les receptes tampó solen ser-les receptes escrites sense explicació o raó per als diferents components. Un buffer d'aquest tipus és glucosa-tris-EDTA o buffer GTE.
$config[code] not foundPer a què serveix GTE?
El GTE s'utilitza per resuspendre els pellets cel·lulars bacterians abans de lisar (trencant oberta) les cèl·lules i es recull el DNA del plasmidi a l'interior. La lisozima, que suavitza les membranes cel·lulars, se sol afegir juntament amb el tampó GTE. Aconseguir una suspensió homogènia de cèl·lules senceres durant aquest pas, de manera que la solució de liti afegida posteriorment pot arribar a totes les cèl·lules, és clau per obtenir bons resultats d'ADN. GTE està dissenyat per fer això, a més de proporcionar un entorn estable per a l'ADN.
Glucosa per a l'osmolaritat
El sucre de glucosa de 50 mM (mil·limíol) s'agrega al buffer GTE per mantenir l'osmolaritat on la concentració de solut que es troba fora de les cel·les és molt propera a l'interior de les cel·les. Això impedeix la lisi cel·lular prematura, que pot provocar una disminució del rendiment de l'ADN a causa de l'agregació i la degradació. Els altres components de la memòria intermèdia també contribueixen a l'osmolaritat de la solució, però la glucosa, que no és electrolítica, és una bona opció perquè no interfereix amb les propietats de la memòria intermèdia de la solució.
Tris per pH Estabilitat
Tris és el nom breu del tris (hidroximetil) aminometà, que és un tampó de pH molt comú. En el cas del buffer GTE, la sal d'àcid (Tris-HCl) s'agrega al buffer a una concentració de 25 mM. Això manté el pH de la solució en un 8,0 proper fisiològic, un pH ideal per prevenir la hidròlisi àcida (degradació) del DNA del plasmidi i les reaccions secundàries no desitjades dels altres components de la cèl·lula.
EDTA evita la degradació de l'ADN
L'EDTA o l'àcid etilendiaminotraacético capturen o ions metàl·lics "quelats" fora de la solució, impedint que participin en reaccions secundàries no desitjades. En el buffer GTE, s'afegeix EDTA a 10 mM. El seu propòsit primordial consisteix en la memòria intermèdia per arrodonir zinc, magnesi i calci lliures, evitant així la degradació de l'ADN per determinades vies que requereixen aquests metalls.
Alguns consells importants
Mantingui el seu tampó GTE fred i ho faci en quantitats reduïdes per evitar el creixement de bacteris no desitjats. El sucre i el pH controlat permeten un gran mitjà de creixement. Utilitzeu sempre aigua purificada. L'aigua de l'aixeta pot tenir un excés de ions metàl·lics de les canonades, que poden aclaparar la capacitat de capturar l'EDTA. Si sospiteu de la presència d'ARN que interfereix en la vostra mostra, afegiu RNasa A a 100 micrograms per mil·lilitre al buffer GTE per eliminar el problema.
